1 – مقدمه سیستم آنالیز اسپرم (CASA Systems)

ناباروری یکی از مشکلات کلینیکی متداولی است که مسائل ثانویۀ بسیاری از جمله فشارهای روانی و اجتماعی و افسردگی را برای زوج نابارور در پی دارد [22] . اولین گام در بررسی علل ناباروری در مردان بررسی کیفی Semen، شامل اندازه گیری حجم، دانسیته ، درصد تحرک و درصد اسپرمهای با مورفولوژی نرمال می باشند. در روش متداول پس از اندازه گیری حجم و pH نمونۀ Semen معمولاٌ روی لام هموسایتومتری و زیر میکروسکوپ مورد مطالعه قرار می گیرد و بسته به میزان تجربه و تخصص بررسی کننده مقادیری تقریبی برای تراکم یا دانسیته اسپرمها و وضعیت حرکت آنها استخراج و اعلام میگردد. مشکل عمدۀ این روش این است که این اطلاعات کیفی به تنهایی ارزش زیادی در پیشبینی احتمال باروری ندارند [24] . بعلاوه، طبق اعلام WHO ‎ [4] نتیجۀ سایر مطالعات انجام شده،[6] [5] ‎ میزان اختلاف نتایج در دفعات مختلف آنالیز توسط یک فرد به طور متوسط بیش از 30 درصد و این میزان اختلاف در نتایج به دست آمده توسط افراد مختلف بیش از 40 درصد می باشد .این مقادیر قابل توجه واریانس Inter Observer و Intra Observer باعث شده است که روش متداول آنالیز اسپرم یک روش قابل اعتماد برای بررسی کیفیت Semen محسوب نگردد. ‎[7] به همین دلیل از اوایل دهه 70 تلاش برای ایجاد یک سیستم اتوماتیک و یا نیمه اتوماتیک کامپیوتری شروع شد تا بتوان با یک روش واحد و مستقل از کاربر تکرار پذیری و در نتیجه قابلیت اعتماد را افزایش داد و نیز پیش بینی شده بود که بتوان بکمک آنالیز کامپیوتری، اطلاعات کمّیِ بیشتر و ارزشمندتری را بدست آورد که استخراج آنها بدون کامپیوتر غیر ممکن ویا بسیار دشوار است. امروزه ارزش تشخیصی پارامترهایی نظیر ALH، VCL، LIN، VSL که تنها توسط سیستمهای آنالیز کامپیوتری قابل محاسبه می باشند، در پیشبینی شانس باروری اثبات شده است ‎[25] . ضمناً این پارامترها در مطالعۀ میزان اثر بخشی درمان و نیز در انتخاب نوع درمان بسیار مفید میباشند.

در اوایل دهه 70 کامپیوترهای قابل استفاده عموم وجود نداشت و کامپیوترهای آن زمان دارای قدرت محاسبات بسیار محدود بودند لذا دریافت تصاویر میکروسکوپی توسط کامپیوتر به طور مستقیم امکان پذیر نبود. لذا این کار تنها در تعداد محدودی از مراکز تحقیقاتی و با عکسبرداری از تصاویر میکروسکوپی به روش میکروگرافی و سپس انتقال آن به کامپیوتر انجام می شد . علاوه بر ضعف کامپیوتر ها در آن دوره روش های پردازش تصویر موجود در آن زمان نیز قادر به تشخیص و آنالیز اسپرم و جداسازی آن از تصاویر زمینه و آرتیفکتها نبود .‎[7]‎[8]

از اواسط دهه 80 با ظهور کامپیوتر های قوی تر و توسعه تکنیکهای پردازش تصویر و نیز تجهیزات دریافت تصاویر دیجیتال ، تحقیق روی روش های اتوماسیون آنالیز اسپرم سرعت بیشتری گرفت بطوری که اولین سیستم های عمومی بدین منظور وارد بازار شدند ‎[9] .از جملۀ این سیستم ها سیستم CellSoft بود، که در سال 1985 وارد بازار شد و از همان زمان نام اختصاری CASA ( Computer Aided Semen Analyses ) برای این سیستمها رایج گردید .

دقت بالاتر ، عدم وابستگی به کاربر و قابل استناد و قابل مقایسه بودن نتایج این سیستم باعث شد که تا سال 1990 بیش از 200 مقاله علمی در زمینه بررسی و ارزیابی نتایج و روش های استفاده از آن و بطور کلی آنالیز اسپرم در شرایط مختلف بر مبنای نتایج حاصل از آن به چاپ رسید که مراجع ‎[10]‎[11]‎[12]‎[13] و ‎[14] نمونه هایی از این مقالات هستند .

سیستم دومی که در سال 1986 برای اولین بار به بازار عرضه شد سیستمHTM-2000 از کمپانی تحقیقاتی Hamilton –Thorn بود و بعد از مدت کوتاهی در سال 1988 سیستم ارتقاء یافتۀ آن به نام HTM-S به بازار عرضه شد و پس از آن نیز در سال 1993 این کمپانی مدل Ivos ودر سال 1992 ،مدل Cerosرا به دنیا عرضه نمود در طول این سالها مقالات زیادی در مورد مقایسه نتایج و ارزیابی این سیستم ها به چاپ رسیده که همگی حاکی از قابلیت اطمینان بسیار سیستم CASA در مقایسه با روش های متداول می باشند [15][16][17][18][19]

موج سوم پیشرفت تکنولوژی کامپیوتر با توسعه کامپیوتر های خانگی شروع شد. امروزه حتی کامپیوترهای ارزان قیمت خانگی نیز از کامپیوترهای اوایل دهه 90 سریعتر و پرقدرت تر هستند. بعلاوه تجهیزات جانبی نظیر دوربین های دیجیتال و تجهیزات انتقال تصاویر دیجیتال به کامپیوتر آنچنان متداول شده اند که دیگر کمتر کسی وجود دارد که در منزل یا محل کار خود با آنها سر و کار نداشته باشد .

در کنار توسعه چشمگیر کامپیوتر و تصویر برداری دیجیتال، پیشرفت و توسعه روشها و الگوریتم های پیچیدۀ پردازش تصویر و ظهور الگوریتم های نوین ریاضی سبب شده تا سیستم های CASA امروزی بسیار سریع ، دقیق و مطمئن عمل نمایند بطوریکه در ویرایش چهارم دستورالعمل WHO برای آنالیز اسپرم در سال1999 به این روش بعنوان روشی مطمئن و قابل اعتماد وتکرار پذیر اشاره و روی آن تأکید شده است ‎[4] .

2- سیستم CASA چیست؟

همانگونه که قبلاً گفته شد CASA از حروف اول عبارت ( Computer Aided Semen Analyses ) به معنی سیستم آنالیز کامپیوتری Semen تشکیل شده است.

این سیستم متشکل از یک میکروسکوپ سه چشمی، یک دوربین CCD ، یک کارت سخت افزاری برای تبدیل تصاویر بصورت دیجیتال، یک کامپیوتر، و بالاخره یک نرم افزار بسیار پیشرفتۀ پردازش و آنالیز تصویر بر اساس تکنیکهای هوش مصنوعی می باشد .

تصویر لام حاوی Semen از طریق چشم سوم میکروسکپ به دوربین CCD منتقل با قدرت تفکیک بالا دریافت می گردد. کارت سخت افزاری فوق الذکر تصاویر را با کیفیت و وضوح بسیار بالا دریافت و در هر ثانیه 50 و یا 60 تصویر را ثبت و تبدیل به تصاویر دیجیتال نموده و در کامپیوتر ذخیره می نماید.

میدانیم که حتی ثبت 25 تصویر در ثانیه برای پیوست دیدن یک تصویر متحرک کافی است لیکن سرعت بالای 50 یا 60 تصویر در ثانیه سبب می شود که حتی مسیر حرکت سریعترین اسپرم ها در نمونه نیز بطور پیوسته و بدون پرش قابل ردیابی و مشاهده باشد ‎[4]

پس از آن، مجموعه تصاویر دیجیتال ثبت شده در کامپیوتر، با تکنیکهای پیشرفتۀ پردازش تصویر و الگوریتم های بسیار دقیق مبتنی بر تکنیکهای هوش مصنوعی مورد بررسی و آنالیز قرار میگیرند. در هر تصویر از مجموعه تصاویر ثبت شده، اسپرم ها بر اساس شکل، رنگ و اندازه از زمینه تصویر و از اجسام دیگر (دبریها) تشخیص داده می شوند و در واقع تمام اسپرم ها در تمامی تصاویر مجموعۀ ثبت شده تشخیص داده می شوند و با توجه به توالی تصاویر ، مسیر حرکت تک تک اسپرم ها به دقت ردیابی و ثبت می شود[26]. تصویر 1، یک نمونه از نتیجۀ تشخیص اسپرمها در یک فیلد را توسط یک سیستم CASA نشان میدهد.

در سیستمهای اولیه و حتی در بعضی از سیستمهای امروزی برای تمایز بیشتر اسپرمها از زمینۀ تصویر از میکروسکپهای Phase Contrast استفاده شده است . لیکن با پیشرفت تکنیکهای پردازش تصویر، سیستمهای جدیدتر به ندرت از این نوع میکروسکپها استفاده می کنند و با استفاده از میکروسکپهای معمولی هزینۀ کلی سیستم را کاهش داده اند.[26].

شکل 1: یک نمونه از نتیجۀ تشخیص اسپرمها در یک فیلد. اسپرمها با حاشیۀ زرد رنگ نشان داده شده اند

3- روش اندازه گیری غلظت اسپرم ها در سیستم CASA چگونه است؟

در سیستم های CASA نمونه Semen توسط لام ویژه ای بنام Sperm Chamber در زیر میکروسکوپ قرار میگیرد . در یک نوع از این اسپرم چمبرها که در سیستم CASA مدل HFT CASA ارائه شده توسط شرکت هوشمند فن آور دارای تاییدیه وزارت بهداشت ودرمان و آموزش پزشکی مورد استفاده قرار می گیرد، چهار عدد پایه از جنس کریستال فشرده روی لام ویژه ای (مطابق شکل 2) نصب شده است که پس ازقرارگیری لامل مخصوص روی آن فاصله سطح لام از لامل در تمامی سطح با دقت بسیار بالا برابر مقدار 01/0 میلی متر یا 10 میکرومتر حفظ میشود. علت استفاده از کریستال استحکام و طول عمر بسیار بالا و عدم تغییر حالت و اندازه در اثر استفاده و شستشو و اصطکاک میباشد .

فضای 10 میکرومتری بین لام و لامل سبب می شود که اسپرم ها بدون محدودیت حرکتی، هرگز از سطح فوکوس میکروسکوپ خارج نشوند . بدین ترتیب در هر فیلد پس از تشخیص تک تک اسپرمها (مشابه نمونۀ نشان داده شده در شکل 1)، و شمارش آنها و محاسبۀ میانگین تعداد اسپرم ها در واحد سطح، می توان بدقت به دانسیته اسپرم در واحد حجم پی برد. بمنظور اندازه گیری دقیق طول و سطح در این سیستمها، آنها را در زمان نصب، توسط لامهای مدرّج دقیق کالیبره مینمایند.

شکل 2 : تصاویر و شمای برش عرضی Sperm Chamber

4- روش Grade بندی اسپرم ها در سیستم HFT CASA چگونه است ؟

جهت بررسی مسیر و سرعت حرکت اسپرمها ، سیستمهای CASA از هر فیلد میکروسکپی برای مدت مشخصی ، مثلاً یک ثانیه، فیلمبرداری میکنند. این کار معادل گرفتن 50 یا 60 تصویر متوالی در هر ثانیه است. همانگونه که در بخش II گفتیم، سیستم های CASA تک تک اسپرم ها را در هرتصویر تشخیص میدهند و با دنبال کردن و ردیابی آنها در تصاویر متوالی ذکر شده مسیر حرکت هر یک از اسپرمها تشخیص داده میشود. معمولاٌ این مسیرها روی یکی از تصاویر هر فیلد ترسیم و به کاربر نیز نشان داده میشوند. همواره علاوه بر مسیر حرکت واقعی اسپرمها، مسیر متوسط حرکت را بدون در نظر گرفتن حرکات زیگ زاگی جانبی آنها را نیز محاسبه و نشان میدهند.

شکل 3 آخرین تصویر از یک مجموعه تصاویر ثبت شده از یک فیلد میکروسکپی نمونه را نشان میدهد که مسیر حرکت واقعی اسپرمها روی آن با رنگ آبی ترسیم شده است. خطوط قرمز رنگ مسیر متوسط حرکت را نشان میدهند.

شکل 3 : خطوط آبی رنگ مسیر واقعی حرکت اسپرمها (مسیری که اسپرمها واقعاٌ طی کرده اند) و خطوط قرمز رنگ مسیر متوسط حرکت را بدون در نظر گرفتن حرکات زیگ زاگی جانبی اسپرمها نشان میدهد.

بدین ترتیب با داشتن مسیر حرکت اسپرمها و با توجه به مشخص بودن مدت زمان ثبت این مسیرها، سرعت حرکت تمامی اسپرم ها در هر فیلد بطور جداگانه ثبت میشود. ضمناٌ علاوه بر سرعت حرکت آنها در مسیر واقعی (VCL) ، سرعت در مسیر مستقیم (VSL) و سرعت اسپرم ها در مسیر متوسط (VAP) نیز محاسبه می شوند ( این پارامترها در بخش IV بطور مبسوط تشریح شده اند).

در اکثر سیستم های CASA علاوه بر میانۀ این مقادیر که بین کلیه اسپرمهای مشاهده شده محاسبه میشود ، نمودار آماری توزیع این سرعتها نیز استخراج و نمایش داده می شود.

مطابق پیشنهاد WHO ‎[4] اسپرم ها بر اساس سرعت های محاسبه شده در 4 گروه A، B، C و D دسته بندی می شوند و مطابق با WHO2010 کلا در سه گروه Progressive، Non Progressive و Immotile طبقه بندی میشوند .

گروه A اسپرم هایی هستند که سریع و پیشرونده ( Progressive ) هستند. اسپرم های گروه B نیز اسپرم های پیشرونده ولی با سرعتی کمتر از گروه A هستند.هردو گروه A و B تحت عنوان Progressive طبقه بندی میشوند. گروه C اسپرم های متحرک اند که حرکتشان پیشرونده نمی باشد و بصورت درجا حرکت می کنند و یا دارای حرکت مارپیچی و چرخشی هستند. و بالاخره گروه D اسپرم های غیر متحرک اند.

بطور معمول برای یک آنالیز اسپرم بین 5 تا 20 فیلد میکروسکوپی مورد بررسی قرار می گیرد. که این تعداد فیلد معادل بررسی 1000 تا 20000 عدد اسپرم می باشد. سیستمهای CASA با حفظ اطلاعات حرکتی و سرعت های متفاوت هریک از اسپرم ها قادرند نمودارهای توزیع آماری سرعت حرکت اسپرم ها را نمایش دهند.

بطور نمونه سیستم CASA مدل HFT CASA نمودار توزیع آماری سرعت های VCL,VSL و VAP را نمایش می دهد (شکل 4 نمونه ای از این نمودارها را نمایش میدهد).

5- ارزش نمودار توزیع آماری سرعت اسپرم در چیست ؟

گرچه سیستم های CASA مشخصات کلیه اسپرم ها را بطور جداگانه محاسبه می نماید لیکن برای ارائه گزارش خلاصه که برای پزشکان بطور کلی قابل استفاده باشد، مقادیر میانۀ پارامتر ها را در یک صفحه گزارش می نماید و این مقادیر میانه برای بررسی و تشخیص اکثر ناهنجاری های Semen و تجویز درمان کافی می باشند.

باید توجه داشت که توزیع آماری بیشتر پارامتر های اندازه گیری شده، از توزیع نرمال پیروی نمی کند، لذا از لحاظ آماری تنها توجه به تغییرات میانه کافی نبوده و توجه به تغییرات منحنی توزیع آماری پارامترها، اطلاعات ارزنده ای را بدست می دهد.

بهمین دلیل، در بسیاری از موارد پیگیری درمان ها و جهت اطلاع از میزان اثر آنها و احیاناً تثبیت و تغییر و یا ادامه روش درمان تنها نمی توان به مقادیر میانه توجه نمود و توجه به تغییرات شکل منحنی های آماری توزیع پارامتر ها می تواند بسیار مفید تر باشد. ‎[4]‎[14]‎[21]‎[22]

شکل 4 : نمونه ای از نمودار توزیع آماری سرعت ها و Grade بندی اسپرم

6– تشریح پارامترهای حرکتی اسپرم

طی سالهایی که سیستم های CASA توسعه یافته اند پارامترهای حرکتی مختلفی توسط آنها تعریف و ارائه شده اند لیکن امروزه WHO مجموعه مشخصی از پارامترها را بدین منظور پیشنهاد کرده است ‎[4] که کلیه سیستم های CASA از آن تبعیت می نمایند.

اگر مسیر حرکت یک اسپرم را از نقطه A به نقطه B مطابق شکل 5 فرض نماییم این پارامترها بدین شرح اند :

VSL ( سرعت مستقیم الخط اسپرم ها برحسب میکرومتر بر ثانیه ) عبارت است از سرعت اسپرم روی خط فرضی مستقیم واصل بین نقطه A و B (مسیر مشخص شده با نقطه چین ) یعنی طول مسیر مستقیم از نقطه A تا نقطه B تقسیم بر زمان طی این مسیر . بدیهی است که هرچه مسیر حرکت اسپرم ها پیچیده تر و غیر خطی تر باشد مسافت مستقیم طی شده کمتر و نهایتاً اسپرم VSL کمتر خواهد بود.

شکل 5 : مسیرهای واقعی، متوسط و مستقیم حرکت اسپرمها

VCL ( سرعت واقعی اسپرم ها در مسیر واقعی طی شده برحسب میکرومتر بر ثانیه ): عبارت است از خارج قسمت طول واقعی طی شده در مسیر پیچیده حرکت اسپرم (مسیر مشخص شده با خط پیوسته) تقسیم بر زمان طی این مسیر

VAP ( سرعت در مسیر منحنی الخط میانگین برحسب میکرومتر بر ثانیه ) : اگر تغییر جهت های سریع اسپرم را نادیده بگیریم می توان فرض کرد که اسپرم ها یک مسیر منحنی الخط متوسط را طی می کنند ( مسیر مشخص شده با خط نقطه ) خارج قسمت طول این مسیر بر زمان طی مسیر ، سرعت در مسیر متوسط یا VAP می باشد.

LIN ( معیار خطی بودن حرکت برحسب درصد ) : این پارامتر یک پارامتر محاسباتی بوده برابر نسبت سرعت VSL برسرعت VCL برحسب درصد می باشد. بدیهی است هرچه مسیر حرکت واقعی اسپرم به خط مستقیم واصل بین دو نقطه ابتدایی و انتهایی نزدیکتر باشد VSL و VCL بهم نزدیکتر و این پارامتر به100 درصد نزدیکتر است.

STR ( معیار مستقیم الخط بودن بر حسب درصد ): این پارامتر نیز یک پارامتر محاسباتی بوده برابر نسبت سرعت VSL به سرعت VAP بر حسب درصد می باشد. این پارامتر نیز بین صفر تا صددرصد است و ملاکی از نزدیک بودن مسیر حرکت متوسط به خط مستقیم واصل بین نقاط ابتدایی و انتهایی است. هرچه این پارامتر به 100 درصد نزدیکتر باشد بدین معنی است که اسپرم گذشته از حرکات سریع زیک زاکی خود بطور متوسط بصورت خطی حرکت کرده است.

WOB ( Wobble بر حسب درصد) : این پارامتر نیز بصورت نسبت سرعت VAP به سرعت VCL برحسب درصد تعریف میشود و بیانگر میزان حرکات تند و زیک زاکی اسپرم حول مسیر میانگین می باشد.

ALH (حداکثر دامنه حرکات جانبی برحسب میکرومتر ): دامنه حرکات جانبی سریع سر اسپرم در اطراف مسیر میانگین بر حسب میکرومتر را حداکثر دامنه حرکات جانبی یا ALH گویند.

MAD ( متوسط زاویه چرخش بر حسب درجه ) : عبارت است از متوسط زاویه تغییر جهت سر اسپرم ها در طول مسیر حرکت را بر حسب درجه.

BCF (فرکانس حرکات جانبی برحسب هرتز ) عبارت است از تعداد دفعاتی که سر اسپرم در هر ثانیه بصورت جانبی حرکت و مسیر میانگین را قطع میکند.

جدول 1، کلیه پارامترهایی را که سیستم آنالیز دینامیک سیستم CASA مدل HFT CASA در گزارش خلاصۀ خود ارائه می نماید ، بطور خلاصه نشان می دهد. همانگونه که پیشتر نیز ذکر شد، علاوه بر این پارامترها نمودارهای توزیع آماری سرعتها و تصاویری از فیلدهای مختلف مشاهده شده نیز قابل چاپ می باشند.

جدول 1 : پارامترهای گزارش خلاصۀ سیستم CASA مدل HFT CASA

مراجع :

1. Bartoov B., Sperm motility index: a parameter for human sperm evaluation Fertility & Sterility, vol. 56, No. 1, 1993.
2. Johnston, Assessment of the Sperm Quality Analyzer, Fertility & Sterility vol. 63, No. 5,1995
3. Martinez1 C., Mar C., Azcrate M., Pascual P., Aritzeta JM., López-tlrrutia A., Sperm motility index: a quick screening parameter from sperm quality analyzer-IIB to rule out oligo- and asthenozoospermia in male fertility study, Human Reproduction, vol.15 No.8 , 2000
4. World Health Organization , WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm –cervical mucus interaction, Fourth Edition, 1999
5. Auger J., Eustaclie F., Diicot B., Blandin T., Daidin M., Diaz I., Intra- and inter-individual variability in human sperm concentration, motility anti vitality assessment during a workshop involving ten laboratories, Human Reproduction vol.15 No.11, 2000
6. DavisO. and Katz D. F., Operational Standards for CASA Instruments, Journal of Andrology, VoL 14, No. 5, 1993
7. Amann R.P., Katz D. F., Reflections on CASA After 25 Years, Journal of Andrology, Vol. 25, No. 3, 2004
8. Katz D.F., Davis R.O., Automatic analysis of human sperm motion. Journal of Andrology, Vol. 8, 1987
9. Katz D.F., Davis R.O., Delandmeter B.A., Overstreet J.W., Real-time analysis of sperm motion using automatic video image digitization. Comput. Methods Programs Biomed. Vol. 21, 1985
10. Mathur S., Carlton, Ziegler J., Rust PF., Williamson HO., A computerized sperm motion analysis. Fertil Steril.Vol. 46, 1986
11. Working PK., Hurtt ME. , Computerized videomicrographic analysis of rat sperm motility, J Androl. Vol. 8, 1987
12. Budworth PR., Amann RP., Chapman PL., Relationships between computerized measurements of motion of frozen-thawed bull spermatozoa and fertility. J Androl.; Vol. 9, 1988
13. Mack SO., Wolf DP., Tash JS., Quantitation of specific parameters of motility in large numbers of human sperm by digital image processing. Biol Reprod. Vol 38, 1988
14. Toth GP., Stober JA., Read EJ., Zenick H., Smith K., The automated analysis of rat sperm motility following subchronic epichlorohydrin administration: methodologic and Statistical considerations. J Androl. Vol 10, 1989
15. Knuth UA., Yeung CH., Nieschlag E., Computerized semen analysis: objective measurement of semen characteristics is biased by subjective parameter setting. Fertil Steril.Vol. 48, 1987
16. Boyers S.P., Davis R.O., Katz D.F., Automated semen analysis. Curr Probl Obstet Gynecol Fertil. Vol 12, 1989
17. Amann RP., Computerized evaluation of stallion sperm. In: Proceedings of the 32^nd Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners. Lexington, Ky; pp. 453–473, 1988
18. Chapin RE., Filler RS., Gulati D., Methods for assessing rat sperm motility. Reprod Toxicol. Vol. 6, 1992
19. Schrader SM., Chapin RE., Clegg ED., Laboratory methods for assessing human sperm quality in epidemiologic studies: a consensus report. Reprod Toxicol. Vol. 6, 1992
20. Mortimer ST., Swan MA., The development of smoothing-independent kinematic measures of capacitating human sperm movement, Human Reproduction vol.14 No.4, 1999
21. Gladen BC., Williams J. , Chapin RE. , Issues in the statistical analysis of sperm motion data derived from computer-assisted systems. J Androl. 12, 1993
22. Vantman D., Koukoulis G., Burris AS., Banks SM., Dennison, Sherins RJ., Sperm motion characteristics in men with isolated hypogonadotropic hypogonadism treated with gonadotropin. Fertil Steril. Vol. 51, 1989
23. Domar A D, Broome A, Zuttermeister P C, Seibel M and Friedman R , The prevalence and predictability of depression in infertile women Fertil. Steril. Vol.58 1992
24. Slott V L, Jeffay S C, Dyer C J, Barbee R R and Perreault S D sperm motion redicts fertility in male hamsters treated with α-chlorohydrin J. Androl. Vol.18 ,1997
25. Acosta A A and Kruger T F Human Spermatozoa in Assisted Reproduction 2^nd ed (London: Parthenon) section 7, 1996
26. Mortimer ST, CASA–practical aspects J. Androl. Vol. 21, 2000